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好久沒提到實(shí)驗(yàn)相關(guān)的內(nèi)容，都快忘記自己是搞實(shí)驗(yàn)出身的了。 最近，陸陸續(xù)續(xù)有多個(gè)粉絲朋友在后臺(tái)咨詢關(guān)于“免疫熒光”的問題，基本都是在問免疫熒光分析的問題。 問題來了。 “ 免疫熒光到底該不該分析？” 關(guān)于這個(gè)話題，我想細(xì)致地采用一問一答的方式進(jìn)行討論。這樣，讀到這篇文章的人不會(huì)產(chǎn)生混亂的感覺。  答：對(duì)于一些指標(biāo)，我們無法檢測其絕對(duì)的含量，只能通過設(shè)置參照指標(biāo)，以參照指標(biāo)的倍數(shù)來反映目標(biāo)物相對(duì)含量，這個(gè)“相對(duì)”是針對(duì)參照的。分析結(jié)果是半定量的，也是沒有單位的，因?yàn)樗举|(zhì)上是一個(gè)比值（目標(biāo)/參照）。 因此，參照指標(biāo)的含量在任何情況下是恒定的，否則就是刻舟求劍。這句話的含義可以再延伸一下，即只要在被測物中存在一個(gè)恒定已知量，就可以采用它作為參考進(jìn)行半定量分析。 答：① Western Blot、ELISA、RT-PCR實(shí)驗(yàn)，經(jīng)常采用GAPDH、β-actin等管家蛋白作為內(nèi)參照，進(jìn)而分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。 ② 免疫組織化學(xué)染色（DAB法）、免疫細(xì)胞化學(xué)染色（DAB法）。同樣也是采用GAPDH、β-actin等管家蛋白作為參照，通過在明場下采集圖像，進(jìn)而使用Image J或Image Pro Plus對(duì)陽性表達(dá)產(chǎn)物的平均光密度進(jìn)行半定量分析。 注意上面標(biāo)紅的文字。DAB染色法是在明場，即光鏡下進(jìn)行觀察，全程不涉及熒光激發(fā)過程。DAB染色后的切片基本不會(huì)褪色。也就是說DAB染色后的切片觀察不會(huì)受到時(shí)間、地點(diǎn)、觀察者變化等影響，其陽性表達(dá)的強(qiáng)度和范圍在封片之后是不變的。這是DAB法染色后能夠進(jìn)行半定量分析的根本原因。 問題3：蛋白免疫熒光適合半定量分析嗎？ 答：不適合。免疫熒光染色的關(guān)鍵是熒光二抗，之后在熒光場下進(jìn)行拍照，留取照片。表面上看，這個(gè)過程與DAB染色后類似，但實(shí)際上其中存在相當(dāng)多的變量，正是這些變量導(dǎo)致免疫熒光染色不適合做半定量分析。 變量①：熒光二抗的質(zhì)量好壞決定了熒光染色效果。同樣一張切片、細(xì)胞爬片，采用國產(chǎn)熒光二抗和進(jìn)口熒光二抗，效果上存在非常大的差異，用過的都知道。此時(shí)，我們難道就能僅僅憑借熒光強(qiáng)度和分布范圍就說蛋白表達(dá)水平不同嗎？顯然不行。 變量②：熒光拍攝條件。拍攝環(huán)境、顯微鏡品牌和激發(fā)熒光決定了鏡下觀察的效果。同樣的操作方法和切片，在不同品牌顯微鏡下顯示出不同的熒光強(qiáng)度。但事實(shí)上，切片上的蛋白從未變化，改變的是拍攝條件。 變量這么多，你還敢對(duì)免疫熒光染色進(jìn)行半定量分析嗎？ 答：在理論上，得到一張蛋白條帶所涉及的操作是相同的，后面對(duì)蛋白進(jìn)行發(fā)光和拍照，這些也是在同一時(shí)刻進(jìn)行的操作。不涉及時(shí)間差的問題。即你是在同一條件、同一時(shí)間對(duì)此條帶上的不同孔進(jìn)行檢測。盡管也存在信號(hào)衰減的問題，但是此時(shí)所有孔代表蛋白的熒光衰減程度是一致的。 熒光染色就不一樣了，它的圖像采集時(shí)間更長，且你不可能同時(shí)對(duì)拍攝所有的切片。這就帶來了非常明顯的時(shí)間差問題，也就放大了熒光衰減對(duì)結(jié)果的影響。 答：TUNEL熒光染色后分析是檢測細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)，是通過將發(fā)光物連接到斷裂DNA的3‘ 斷端上，它不是一個(gè)絕對(duì)的免疫反應(yīng)過程。TUNEL熒光染色分析的本質(zhì)是一個(gè)計(jì)數(shù)問題，即通過計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞核的數(shù)量，來分析該張組織切片或細(xì)胞爬片上的凋亡指數(shù)。這個(gè)過程，我們的計(jì)數(shù)不會(huì)受到熒光衰減的強(qiáng)烈影響。只要判斷出熒光信號(hào)確實(shí)屬于凋亡細(xì)胞核，不管其信號(hào)點(diǎn)的大小如何，只要存在信號(hào)，我們就可以計(jì)數(shù)為1個(gè)凋亡核。 但是免疫熒光就完全不一樣了。蛋白的表達(dá)水平直接通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱和分布范圍來體現(xiàn)。一旦信號(hào)衰減，陽性物的熒光就會(huì)衰減，分布面積會(huì)減小。此時(shí)我們無法再評(píng)價(jià)蛋白的表達(dá)水平了。  答：免疫熒光本質(zhì)上最適合作為定位分析指標(biāo)。我們可以通過不同的熒光二抗，在不同的激發(fā)光下，在同一張切片上的merge出不同染色效果。借此，我們可以對(duì)研究的蛋白分布范圍、空間相互關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)。這對(duì)于研究細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)或者是蛋白受體等十分重要。常規(guī)的DAB染色根本無法滿足要求。
答： ①PCR檢測蛋白所對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)水平； ②Western Blot作為主要的蛋白半定量分析方法； ③采用免疫組織化學(xué)染色或免疫細(xì)胞化學(xué)染色（DAB法）進(jìn)一步對(duì)蛋白表達(dá)的位置（胞外、胞膜、胞質(zhì)、胞核）進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過采用半定量分析法分析蛋白表達(dá)水平，鞏固Western Blot半定量分析的結(jié)果； ④采用免疫熒光的方法，對(duì)目標(biāo)蛋白的空間分布進(jìn)行再評(píng)估，以鞏固免疫化學(xué)染色時(shí)對(duì)蛋白空間分布的評(píng)估，同時(shí)能豐富整個(gè)研究的色彩； ⑤有必要的話，可進(jìn)一步采用以上四種方法研究目標(biāo)蛋白的受體，搞清楚其上下游和同水平的調(diào)控關(guān)系。 |
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