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2019年，美國范德比爾特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Johanna C. Sierra等人，在PNAS上發(fā)表了關(guān)于癌癥預(yù)防劑α-二氟甲基鳥氨酸（以下簡稱DFMO）在蒙古沙鼠體內(nèi)能降低幽門螺桿菌引起的胃癌發(fā)生的作用，驗(yàn)證了DFMO在體外處理幽門螺桿菌7.13可誘導(dǎo)引起DNA氧化損傷、DNA修復(fù)酶MutS2的表達(dá)和cagY突變，并導(dǎo)致4型分泌系統(tǒng)功能喪失，從而減少癌癥的發(fā)展。DFMO靶向幽門螺桿菌毒力可能代表胃癌化學(xué)預(yù)防的新策略。 研究背景 幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）是世界上最常見的感染之一，是引起胃腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。幽門螺桿菌定植之后，強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致胃黏膜炎癥，長期感染會引起胃癌的發(fā)生。此外，H. pylori可通過空泡毒素VacA、CagA等多種毒力因子直接損傷胃上皮。CagA由4型分泌系統(tǒng)（T4SS）直接注入上皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞之間的緊密連接，引起細(xì)胞極性的喪失，激活炎癥轉(zhuǎn)錄因子，這些都與細(xì)胞的惡性變相關(guān)。T4SS的分泌器之一是由cagY基因編碼的cagY蛋白，存在于外膜，也是T4SS針核復(fù)合物的組成部分。cagY顯示出大量的DNA重復(fù)序列，集中在5’區(qū)和中間區(qū)的兩個(gè)保守區(qū)。這些重復(fù)序列使cagY基因容易發(fā)生重排，導(dǎo)致T4SS功能的改變，從而導(dǎo)致CagA易位。 結(jié)果1 用DFMO能降低感染H.pylori 7.13的蒙古沙鼠的胃癌發(fā)生率 研究人員首先評估了DFMO對幽門螺桿菌毒力的影響，他們?yōu)楦腥玖?/span>H.pylori 7.13的蒙古沙鼠提供飲用水，水里添加DFMO。已有研究表明H.pylori 7.13可誘發(fā)胃癌的高發(fā)生率，并具有可重復(fù)性。他們在感染的沙鼠中觀察到浸潤性腺癌，腺體穿透過肌層粘膜進(jìn)入粘膜下層（圖1A）。相比之下，服用DFMO的沙鼠僅表現(xiàn)出輕度的不典型增生（圖1A）。在未治療組中，發(fā)現(xiàn)87.5％的沙鼠中觀察到了腺癌（圖1B）。而DFMO治療使得胃腺癌顯著減少至46.7％（圖1B）。在炎癥評分中，DFMO處理的沙鼠和未經(jīng)治療的沙鼠之間沒有顯著差異（圖1C）。而炎癥評分低的沙鼠沒有癌癥，但研究人員發(fā)現(xiàn)有四個(gè)炎癥評分高的沙鼠沒有患上癌癥。 圖1 用H. pylori 7.13感染蒙古沙鼠12周，并在飲水中加入1%DMFO處理 結(jié)果2 DFMO處理組沙鼠中的分離菌株表現(xiàn)出CagA易位減少 接下來，研究人員從感染的沙鼠胃中回收H. pylori 7.13，用于評估T4SS功能變化。他們發(fā)現(xiàn)與來自未經(jīng)處理的沙鼠的H. pylori 7.13相比，DFMO處理的沙鼠的H. pylori 7.13菌株降低了轉(zhuǎn)運(yùn)CagA的能力（圖1D和E）。同樣， 來自DFMO處理的沙鼠的H .pylori 7.13分離株轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞之后，發(fā)現(xiàn)AGS細(xì)胞誘導(dǎo)NF-κB活化的能力降低（圖1F），前人研究表明CXCL8表達(dá)部分取決于胃上皮中的CagA磷酸化細(xì)胞，研究人員發(fā)現(xiàn)在DFMO處理組的菌株與未處理組沙鼠中分離得到的菌株相比，CXCL8確實(shí)減少表達(dá)（圖1G）。 結(jié)果3 DFMO處理沙鼠的分離菌株表現(xiàn)出cagY重排 研究人員使用PCR和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析cagY基因，發(fā)現(xiàn)來自DFMO處理的菌株的cagY發(fā)生了重排，而與原始菌株7.13相比，來自DFMO處理的沙鼠的多株分離菌株表現(xiàn)出RFLP模式的改變（圖2A）。使用針對MRR的抗體，他們發(fā)現(xiàn)了與原始菌株相比，分離株（DFMO-2，DFMO-4，DFMO-5和DFMO-8）的cagY發(fā)生重排（圖2A）。除cagY外，幽門螺桿菌中的許多基因還包含DNA重復(fù)序列，有可能進(jìn)行重組或重排 。 結(jié)果4 DFMO誘導(dǎo)的重排可消除毒性和致癌潛力 為了評估cagY對于CagA易位的影響，研究人員將原始菌株7.13中的cagY敲除，然后用來自兩個(gè)DFMO處理后菌株（DFMO-4和DFMO-8）回補(bǔ)上cagY，RFLP分析 cagY（圖2D）和SMRT測序證實(shí)回補(bǔ)菌株具有與DFMO-4相同的模式；還在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了互補(bǔ)的CagY的蛋白質(zhì)印跡條帶（圖2E）。與WT相比，CXCL8分泌明顯減少（圖2F）。7.13菌株誘導(dǎo)的CXCL8分泌與cagY互補(bǔ)菌株DFMO-4和DFMO-8的排放量也明顯減少（圖2G）。 圖2 蒙古沙鼠分離菌株的cagY重排 結(jié)果5 體外實(shí)驗(yàn)中證明DFMO通過促進(jìn)cagY重排改變T4SS功能 接下來，研究人員用DFMO-4、7.13（DFMO-4）感染蒙古沙鼠，7.13（DFMO-4）表示原始菌株中回補(bǔ)了來自DFMO-4的cagY基因，并在12周后進(jìn)行分析以評估疾病發(fā)生發(fā)展。7.13（DFMO-4）感染沙鼠后炎癥評分顯著降低，因?yàn)樗衼碜苑蛛x物DFMO-4的cagY基因（圖3A）。在感染了7.13菌株的沙鼠中有87.5％發(fā)生了浸潤性腺癌和/或不典型增生（圖3B）。感染7.13（DFMO-4）的菌株的沙鼠中致癌作用明顯減少。DFMO-4或7.13（DFMO-4）感染的沙鼠發(fā)展成侵襲性腺癌（圖3B）。而且，感染 DFMO-4的沙鼠沒有發(fā)育異常，感染7.13（DFMO-4）的沙鼠只有16.6％發(fā)育異常（圖3B）。7.13（DFMO-4）感染組沒有出現(xiàn)癌癥，但是他們觀察到不同程度的炎癥，這可能提示DFMO-4中可能會有cagY以外的其他基因發(fā)生改變。7.13感染組出現(xiàn)代表性的浸潤性腺癌病例（圖3C）。相反，沙鼠感染 DFMO-4或7.13（DFMO-4）的組織學(xué)正常， 胃炎無增生。 研究人員認(rèn)為DFMO可能直接影響H.pylori 7.13的T4SS功能。他們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)將幽門螺桿菌在補(bǔ)充胰蛋白酶以及DFMO的大豆血瓊脂平板上連續(xù)傳代，與不含DFMO或含有鳥氨酸一起用作對照。首先，他們發(fā)現(xiàn)在含DFMO的瓊脂平板上，幽門螺桿菌對DFMO能夠吸收。發(fā)現(xiàn)了DFMO處理的細(xì)菌中的基因cagY的重排早在第5代就發(fā)生（圖4A）；他們觀察到這種重新排列一直到20號（圖4A）。相反，在常規(guī)平板或含鳥氨酸上連續(xù)傳代的菌株中未觀察到重排（圖4A）。而且，與原始菌株7.13相比，體外用DFMO處理后cagY的變化與H.pylori 7.13誘導(dǎo)NF-κB能力下降有關(guān)激活，顯示NF-κB激活至少減少50％（圖4B）。在經(jīng)DFMO處理的菌株中CagA易位明顯減少，但在對照或鳥氨酸處理的細(xì)菌中沒有發(fā)現(xiàn)減少（圖4C和D）。 圖3 用H.pylori 7.13、DFMO-4、原始株加重組cagY（7.13 DFMO-4）感染蒙古沙鼠12周 圖4 幽門螺旋7.13在含有DFMO培養(yǎng)板上連續(xù)傳代 結(jié)果6 DFMO誘導(dǎo)幽門螺桿菌DNA氧化損傷 為了確定DFMO對幽門螺桿菌的潛在氧化作用，研究人員首先評估了過氧化氫酶氧化應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)（katA）和超氧化物歧化酶（sodB）。與未處理相比，DFMO菌株katA和sodB mRNA表達(dá)增加（圖5）。鳥氨酸治療未引起這些基因表達(dá)的明顯改變。通過熒光染色直接評估DNA損傷，使用熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白結(jié)合的8-氧代鳥嘌呤對氧化的堿具有高特異性（圖6）；使用共聚焦顯微鏡檢測DFMO治療幽門螺桿菌24h誘導(dǎo)的DNA損傷（圖6A），并且還觀察到與8-氧鳥嘌呤陽性細(xì)胞的百分比相比，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)DFMO處理的菌株顯著增加（圖6B和C）。 圖5 DFMO對幽門螺桿菌sodB和katA基因表達(dá)的影響 圖6 幽門螺桿菌DNA氧化損傷 結(jié)果7 mutS2的敲除增加了DFMO誘導(dǎo)的DNA損傷并阻止了cagY重排 研究人員觀察到與未經(jīng)治療組或鳥氨酸治療組相比，DFMO處理的H.pylori 7.13中mRNA的表達(dá)增加（圖7A）。 據(jù)報(bào)道，H.pylori 7.13的mutS2缺失突變體顯示對氧化應(yīng)激的敏感性增加。接下來他們構(gòu)建了H.pylori 7.13中mutS2的同基因突變體以評估 DFMO菌株。通過流式細(xì)胞術(shù)評估WT，在ΔmutS2菌株中觀察到DFMO處理DNA損傷后增加（圖7B）。相似的在三個(gè)不同的ΔmutS2中觀察到了氧鳥嘌呤DFMO處理后陽性細(xì)菌。然后，他們確定了mutS2缺失對DFMO誘導(dǎo)的cagY重排頻率的影響。在含DFMO的平板中經(jīng)過五代，他們沒有觀察到 ΔmutS2菌株的重排（圖7C）。相反，如圖4所示，在補(bǔ)充DFMO的板中連續(xù)傳代后WT菌株中的cagY進(jìn)行了重排（圖7C）。 圖7 H. pylori ΔmutS2 的DNA氧化損傷和cagY RFLP結(jié)果 討論 1.癌癥化學(xué)預(yù)防藥α-二氟甲基鳥氨酸（DFMO）可以減少幽門螺桿菌7.13介導(dǎo)的蒙古沙鼠胃癌發(fā)病率； 2.DFMO治療處理的沙鼠中分離得到的菌株在胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)CagA的能力減弱； 3.DFMO引起的幽門螺旋桿菌7.13誘導(dǎo)氧化性DNA損傷，DNA修復(fù)酶MutS2以及cagY中的突變表明 DFMO直接影響基因組穩(wěn)定性。 1.Hooi JKY, et al. (2017) Global prevalence of Helicobacter pylori infection: Systematic review and meta-analysis. Gastroenterology 153:420–429. 2.Parsonnet J, et al. (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma.N Engl J Med 325:1127–1131. 3.Rohde M, Püls J, Buhrdorf R, Fischer W, Haas R (2003) A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol Microbiol 49:219–234. 4.Frick-Cheng AE, et al. (2016) Molecular and structural analysis of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system core complex. MBio 7:e02001–e02015. 5.Suarez G, et al. (2017) Genetic manipulation of Helicobacter pylori virulence function by host carcinogenic phenotypes. Cancer Res 77:2401–2412 原文鏈接： https://www./content/116/11/5077.long ◆《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》“Clinical Practice”版塊發(fā)表強(qiáng)調(diào)幽門螺桿菌的病例摘要 ◆重磅！Lancet子刊發(fā)文證實(shí)現(xiàn)行幽門螺桿菌根除方案的長期安全性 ◆隨訪22年,北大腫瘤醫(yī)學(xué)院學(xué)者發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌根除治療，長期補(bǔ)充維生素和大蒜，可降低胃癌風(fēng)險(xiǎn) 撰稿：童倩 校對：BHK 編輯：白越凡 |
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